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作者：赵菲，姜军，范林军，杨新华，张毅
【关键词】  基因
    Pglycoprotein expression in the development of primary multidrug resistance in breast carcinoma
　　【Abstract】 AIM:  To study the expression and significance of Pglycoprotein (Pgp) in the development of multidrug resistance in breast cancer. METHODS:  The expression of Pgp and MDR1 mRNA were detected by immunohistochemistry and reverse tranmxwy.comionpolymerase chain reaction (RTPCR) in the specimens from 25 breast cancer patients with neoadjuvant chemotherapy (NAC group), 15 breast cancer patients without neoadjuvant chemotherapy (nonNAC group) and 10 patients with breast adenosis (control group). RESULTS:  The positive rate of Pgp expression was 84.0%（21/25）, 46.7%（7/15）and 0 in NAC group, nonNAC group and control group, respectively. MDR1 mRNA expression was 84.0%（21/25）, 53.3%（8/15）and 10%（1/10） in  three groups respectively. Significant difference was found between the three groups (P<0.01). CONCLUSION:  Some tumor cells tolerances to chemotherapeutics increase during the process of oncogenesis and the tolerances can be induced by an extremely low expression of MDR1/Pgp. MDR1/Pgp is associated with the intrinsic multidrug resistance in breast carcinoma.
　　【Keywords】 Pglycoprotein;  genes, MDR;  breast neoplasms
　　【摘要】　目的：　研究乳腺癌原发性耐药过程中P糖蛋白（Pglycoprotein, Pgp）的表达特征，初步探讨乳腺癌原发性耐药的发生机制.   方法：  采用免疫组织化学及逆转录多聚酶链反应技术，对25例接受术前新辅助化疗的乳腺癌患者、15例未接受术前化疗的乳腺癌患者、10例乳腺腺病患者组织标本内Pgp 和MDR1 mRNA的表达情况进行检测.   结果：  Pgp表达阳性率在乳腺癌术前化疗组患者和未化疗组患者中分别为84.0%（21/25）和46.7%（7/15），对照组未见Pgp表达； MDR1表达阳性率在三组则分别为84.0%（21/25）、53.3%（8/15）和10%（1/10），组间差异均显著（P＜0.01）.   结论：　部分乳腺癌细胞在恶性变的过程中同时伴有对化疗药物耐受能力的增加，肿瘤细胞内极低水平的MDR1 mRNA表达即可导致多药耐药，MDR1/Pgp与乳腺癌的内源性耐药相关.
　　【关键词】　P糖蛋白；基因，MDR；乳腺肿瘤
　　0引言
　　多药耐药（multidrug resistance, MDR）是肿瘤治疗失败的重要原因. 目前对MDR的研究主要集中于肿瘤细胞在化疗药物诱导下所产生的获得性耐药，对内源性耐药机制的研究则尚欠深入. 而在临床治疗中，若预先了解肿瘤细胞的内源性耐药状况，不仅可以避免因使用MDR型药物而导致的获得性多药耐药，而且可以针对肿瘤的耐药特点使用逆转剂，提高化疗效果. 我们通过免疫组化方法及RTPCR法检测P糖蛋白（Pglycoprotein, Pgp）及其编码基因MDR1（multidrug resistance 1）在乳腺癌原发性耐药过程中的表达.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　200302/200310住院女性乳腺癌患者接受术前化疗者25例（术前化疗组），未行术前化疗者15例（术前未化疗组），乳腺腺病手术患者10例（对照组）. 3组患者年龄无显著差异，组间均衡性好. 取材后标本直接置于液氮中冻存备用. 采用福州迈新生物技术开发公司的免疫组化染色试剂盒与即用型抗Pgp mAb.
　　1.2方法
　　按说明书进行.  Pgp以胞质和胞膜呈棕黄色着色为阳性，染色强度与阳性细胞的百分比乘积>3分为免疫反应（+）. 　　采用Roche公司的Tripure试剂提取组织总RNA. 获得的RNA行琼脂糖凝胶电泳见清晰的28 S, 18 S rRNA条带；紫外分光光度仪测定其260 nm及280 nm的A值比值>1.65，证实样本无污染. RNA浓度=A260×37×500 mg/L. RTPCR采用两步法，逆转录反应体系： 5×缓冲液5.0 μL， 10 mmol/L dNTP 1.25 μL， 40 MU/L Rnasin 0.625 μL， 200 MU/L MMlV逆转录酶1.0 μL，加DEPC去离子水至总体积25 μL，PCR仪上42℃逆转录60 min, 99℃ 5 min灭活逆转录酶；PCR反应体系： 逆转录产物10 μL，10×缓冲液5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 8 μL， 2.5 mmol/L dNTP 4 μL， 5 MU/L Taq酶0.25 μL， 20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，并设βactin为内参，加DEPC去离子水至总体积50 μL. 引物序列如下： MDR1： 上游5′GTTGCCATTGACTGAAAGAAC3′，下游5′ ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA3′；βactin：上游5′CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3′，下游5′AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGA3′. 反应条件：开始94℃ 5 min充分变性，而后变性94℃ 45 s，退火59℃ 50 s，

延伸72℃ 90 s，30个循环，最后72℃延伸10 min. 取PCR产物10 μL，加入含溴酚蓝的上样缓冲液1 μL，于1.5 g/L琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下照相并保存. 凝胶照相后，于Gel Doc 2000凝胶图像分析系统进行扫描，用Quantity one Version 4.0软件分析. 测定产物条带的积分吸光度（integral absorbance, IA）

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