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 作者：易方方，唐其柱，冯斯婷，王腾
【关键词】  白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流
　　Effects of resveratrol on Ltype calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of resveratrol on the Ltype calcium current (ICaL) in isolated ventricular myocytes of  guinea pig. METHODS: Single ventricular cell was obtained from healthy guinea pig heart using enzymatic dissociation methods. The wholecell patch clamp was used to record the ICaL following the administration of resveratrol at 1, 50, 100 μmol/L. RESULTS: ① Resveratrol reduced the ICaL in a concentrationdependent manner, but it had no effect on IV shape of ICaL. ② Resveratrol markedly shifted the steadystate activation curve of ICaL to the right,  and V1/2 value increased from (-18.97±4.08) mV in control to (-15.97±4.13) mV in the presence of resveratrol （n=7, P=0.02）, the κ value from (3.64±0.56) to (3.82±0.60) (n=7，P=0.67). ③ Inactivation curve of ICaL was not affected significantly. ④ The time constant of reactivation of ICaL  was reduced from (98.50±9.00) ms to (54.53±4.27) ms (n=6，P=0.000) by resveratrol. CONCLUSION: Resveratrol inhibited the Ltype calcium channel, mainly acting on the activity and recovery processes.
　　【Keywords】 resveratrol；wholecell patch clamp；calcium current
　　【摘要】 目的：研究白藜芦醇对正常豚鼠心室肌细胞L型钙电流（ICaL）的影响. 方法：采用全细胞膜片钳技术,记录不同浓度白藜芦醇作用前后对ICaL的影响. 结果：①白藜芦醇呈浓度依赖性阻断ICaL,但对激活电位、峰电位、反转电位均没有影响；②白藜芦醇使ICaL稳态激活曲线右移，V1/2由对照的（-18.97±4.08） mV变为（-15.97±4.13） mV （n=7，P=0.02），κ由（3.64±0.56）变为（3.82±0.60）（n=7，P=0.67）；③对失活曲线无影响，不改变ICaL失活特性；④白藜芦醇使ICaL失活后再恢复时间常数τ缩短，从（98.50±9.00） ms变为（54.53±4.27） ms（n=6，P=0.000）. 结论：白藜芦醇对ICaL有阻断作用,主要作用于钙通道激活和恢复过程.
　　【关键词】 白藜芦醇；全细胞膜片钳；钙电流
　　0引言
　　白藜芦醇化学名为3,5,4′三羟基反二苯代乙烯(3,5,4′ trihydroxyrans stilbene)，是一种主要存在于葡萄皮、花生中的多酚类植物抗毒素. 现认为它是适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因子［1］. 大量研究［2-3］发现白藜芦醇对心肌缺血－再灌注损伤有保护作用；对血管有广泛的舒张效应［4］;能抗动脉粥样硬化，防治冠心病［5］. 但其对心肌细胞离子通道的作用少见报道，我们采用膜片钳技术研究白藜芦醇对心室肌细胞ICaL的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料健康成年豚鼠31只（武汉大学医学院动物中心），体质量250~350 g，雌雄不拘； I型胶原酶，蛋白酶E,HEPES（Gibco公司）； CSOH, CSCl, Na2ATP（Sigma公司）；白藜芦醇（西安赛得高科生物股份有限公司）；其余均为国产分析纯. 无钙台氏液 (mmol/L)：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl2 1，NaH2PO4 0.33，Glucose 20，HEPES 10，pH 7.38 (NaOH调节);KB液(mmol/L)： glumatic acid 50，KOH 85，KCl 30，MgSO4 3，Taurine 20，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5，pH 7.2(KOH调节)；电极外液组成(mmol/L)：NaCl 37，Choline Chloride 100，CaCl2 1.8，MgCl2 0.5， HEPES 10，Glucose 10，CSCl 4.6，pH 7.3(CSOH调节)；电极内液组成(mmol/L): CSCl 120， CaCl2 1.0， MgCl2 5， Na2ATP 5，EGTA 11， HEPES 10，Glucose 11，pH 7.4(CSOH调

节). 白藜芦醇在DMSO中配成1.5 mmol/L母液，每次实验时,母液溶于电极外液中配成实验所需终浓度进行灌流,DMSO终浓度低于1 mL/L.
　　1.2方法
　　1.2.1心室肌细胞的分离将豚鼠腹腔注射肝素500 U/kg，头部击昏,迅速开胸取出心脏置于1000 mL/L O2饱和的4℃生理盐水中冲洗，剪开心包，连接于Langendorff心脏灌流装置上逆行灌流，灌流压维持在70 mm H2O，用无钙台氏液灌流3～5 min，冲出心脏内残留血液，心脏完全停跳后，改用含0.33 mg/L Ⅰ型胶原酶，0.1 mg/L蛋白酶E的低钙液（Ca2+ 80 mmol/L）灌流3~5 min,至心脏膨大松弛流出液成丝后取下，除去心房，在含BSA 1 g/L的KB液中剪碎心室肌，37℃温孵，稀释，倒出上清液, 此为第一份细胞贮存液. 剩余的沉淀部分继续用KB液温孵，稀释，倒出上清依次可以得到多份细胞存储液. 灌流液始终给予1000 mL/L O2饱和,循环水浴使灌流液保温在37℃左右.
　　1.2.2全细胞记录技术吸数滴细胞保存液加于1.5 mL灌流槽，置于倒置显微镜（Olympus IX70）载物台上，待细胞静置贴壁，细胞外液灌流清洗细胞，电极选用硬质玻璃(上海神经生理所提供),经微电极拉制(Narishige PB7)二次拉制而成,电极充以内液后阻抗3.5～5 MΩ. 选取横纹清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞，采用微电极操纵仪(Narishige MD320)移动电极，当电极尖端与细胞表面形成高阻抗封接后（＞2 GΩ）,补偿电极与细胞膜之间的电容

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