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作者：苏明权，岳乔红，周萍，段艳，杨柳，杨军兰，刘家云，郝晓柯
【关键词】  结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA
　　Preparation and antigenicity assay of recombinant proteins of Mycobacterium tuberculosis
　　【Abstract】 AIM: To clone and express the Mr 16×103 and Mr 38×103 proteins of Mycobacterium tuberculosis in E. coli， and to characterize its antigenicity and specificity. METHODS: The Mr 16×103 and Mr 38×103 antigen genes were amplified from Mycobacterium tuberculosis genome DNA by polymerase chain reactions and cloned into pGEX4T2 expression vector after sequencing. BL21 strain of E.coli was transformed with the recombinant vectors and induced to express recombinant proteins. The proteins were purified by affinity column chromatography. The antigenicity and specificity of purified proteins were estimated by enzymelinked immunoabsorbant assay. RESULTS: The BL21 strains of E. coli with recombinant vectors showed 42％ and 18% of Mr 16×103 （688 mg/L） and Mr 38×103 （217 mg/L） gene expressions after induction.  The sensitivity of Mr 16×103 and Mr 38×103 proteins were 67.0％ and 79.8％, specificity were 100％ and 99％，accuracy were 84.0％ and 89.7％ respectively. CONCLUSION: The expressions and purifications of recombinant Mr 16×103 and Mr 38×103 antigens with good antigenicity and specificity facilitate their research and clinical application in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.
　　【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis； antigen； gene expression； enzymelinked immunoabsorbant assay
　　【摘要】 目的：克隆表达结核分枝杆菌Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白，测定其抗原性和特异性. 方法： 利用聚合酶链反应自结核分枝杆菌基因组DNA扩增Mr 16×103和Mr 38×103抗原基因，经测序鉴定后克隆于pGEX4T2表达载体，转化于大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其抗原性与特异性. 结果：携带重组质粒的菌株经诱导产生的表达量分别为42％和18％；Mr 16×103和Mr 38×103蛋白量分别为：688 mg/L和217 mg/L. 其中Mr 16×103蛋白作为包被抗原ELISA法检测的灵敏度为67.0％, 特异性为100％, 准确性为84.0％；Mr 38×103蛋白作为包被抗原ELISA检测的灵敏度为79.8%,特异性为99%，准确性为89.7%. 结论：以Mr 16×103，Mr 38×103重组蛋白为抗原具有良好的抗原性和特异性，可用于结核分枝杆菌诊断方法的建立及临床诊断.
　　【关键词】 结核分枝杆菌；抗原；基因表达；ELISA
　　【中图号】 R378
　　0引言
　　结核病仍是目前危害全球人类健康的重要传染病，我国每年约有13万人因结核病而死亡. 对结核病的实验诊断主要依据细菌学检查和血清学检测，细菌学检查繁琐费时，培养周期长，达不到快速诊断的目的，血清学检测是一种方便快捷的实验室诊断方法，血清学检查的关键是结核分枝杆菌特异性抗原的提呈. 我们利用基因工程重组方法，通过大肠杆菌表达结核分枝杆菌的Mr 16×103和Mr 38×103蛋白，以Mr 16×103和Mr 38×103重组蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验测定两种抗原的反应性和特异性，以期证实其在血清学诊断中的价值.
　　1材料和方法
　　1.1材料结核分枝杆菌H37RV标准株（菌株号：ATCC27294）：购自卫生部国家菌种保存中心. E.coli DH5α，E.coli BL21由第四军医大学西京医院检验科保存；T4连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ, EcoRⅠDNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Vitagene公司；GST亲和层析柱GSTrapFF购自Pharmacia公司；pGEX4T2表达载体购自Pharmacia公司.
　　1.2方法
　　1.2.1结核分枝杆菌Mr

16×103，Mr 38×103抗原基因的PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv培养物经煮沸灭活，蛋白酶K消化过夜，经酚. 氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA. 通过PCR扩增Mr 16×103，Mr 38×103基因. Mr 16×103抗原基因引物为： 5′AGGGGATCCATGGCCACCACCCTTCCCGTTCAG3′含BamH I酶切位点和起始密码子，5′TCAGCTCGAGCCCAGTGGTCAGTTGGTGGACCG3′含Xoh I酶切位点和终止密码子，预期扩增产物435 bp. Mr 38×103基因引物为：5′AGGGGATCCGTGAAAATTCGTTTGCATACGCT3′含BamH I酶切位点和起始密码子，5′GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG3′含Xoh I酶切位点和终止密码子，预期扩增产物1122 bp. PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min. 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果.
　　1.2.2基因的克隆与鉴定用胶回收试剂盒回收目的片段，将Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因与质粒pGEX4T2同时用BamH I与Xoh I双酶切，T4连接酶连接，重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞. 利用Vitagene公司提供的小量质粒提取试剂提取质粒DNA，序列测定由上海生工生物工程公司完成.
　　1.2.3表达载体的构建将携带Mr 16×103，Mr 38×103抗原基因的重组质粒进行双酶切，

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