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0稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，利用化学发光法进行显色反应，用图像分析系统对所得区带积分光密度进行扫描.
　　1.2.4一氧化氮（NO）水平测定标本处理、储存和组织匀浆液提取同Western blot，-80℃保存. 按照试剂盒说明测定NO水平.
　　统计学处理: 数据用x±s表示，SPSS统计软件处理，两组数据间比较采用t检验，多组比较采用多个样本均数比较的ANOVA方差分析，两两比较采用NewmanKeuls法q检验. P<0.05表示有显著性差异.
　　2结果
　　2.1病理学术后28 d，对照支架组血管内膜明显增生，支架丝处中膜受压，轻度萎缩；二烯丙基三硫化物支架组血管内膜增生较对照组显著减轻（图1），计算机图像分析结果有差异（表1）.
　　2.2支架置入术后iNOS蛋白表达Western blot及其积分光密度分析结果显示，正常动脉的iNOS蛋白表达量为0.80±0.12，对照支架置入术后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白（4.3±0.6）表达，术后3 d（14.1±2.7）表达增加，术后10 d（37.3±2.5）达高峰，28 d（11.5±1.3）时仍可检测到iNOS蛋白表达（图2）. 二烯丙基三硫化物涂层支架组iNOS蛋白表达的动态变化规律同对照支架组，但在各时间点的表达量（1 d：29±4；3 d：49.9±3.0；10 d：101±12；28 d：38±3，P均＜0.01）均高于对照支架组.
图1病理学观察支架置入28 d后内膜增生情况HE ×200（略）
　　表1术后28 d, 二烯丙基三硫化物涂层支架组和对照支架组结果比较（略）
　　图2对照支架和二烯丙基三硫化物涂层支架置入犬冠状动脉后iNOS蛋白表达（略）
　　2.3支架置入术后一氧化氮水平支架置入后血管组织中一氧化氮水平变化与iNOS蛋白变化基本一致，术后1 d时一氧化氮生成量［(42±7) μmol/L］低于正常组织［(110±12) μmol/L］，3 d时一氧化氮水平［(126±17) μmol/L］升高，10 d时［(396±39) μmol/L］最高，28 d时为［(195±41) μmol/L］降至基线水平. 二烯丙基三硫化物涂层支架组术后1, 3和10 d时一氧化氮水平［(170±29) μmol/L，P＜0.05；(393±58) μmol/L，P＜0.05；(780±115) μmol/L，P＜0.01］明显高于对照支架组，28 d时一氧化氮水平［(278±37) μmol/L］与对照支架组无明显差异(P>0.05).
　　3讨论
　　血管损伤后iNOS高表达已成共识. 血管损伤后iNOS高表达、NO大量产生，因NO具有舒张血管，抑制血小板粘附、血栓形成，抑制VSMC增殖和细胞外基质合成以及促进VSMC凋亡等作用，故有利于防止损伤后血管收缩和血栓形成［1-4］；但也有研究者发现去除iNOS基因的小鼠在血管损伤后内膜增生程度反而比正常小鼠减轻［6］，从而认为iNOS基因的高表达可能促进了内膜增生. 本研究结果首先证实了支架置入后iNOS大量表达这一观点，还发现二烯丙基三硫化物涂层支架可使损伤局部iNOS蛋白表达进一步增加的同时抑制了内膜增生，表明iNOS的高表达可减轻血管损伤后内膜增生.
　　那么为何血管损伤后iNOS高表达，NO大量生成，VSMC增殖仍然旺盛呢？Yan等［1］解释了这一看似矛盾的现象，他们发现血管内膜和中膜SMC在受到诱导后均可表达iNOS，并产生NO，但相同浓度细胞因子刺激下，内膜SMC表达iNOS和产生NO量远高于中膜（8~10倍），然而内膜SMC增殖被抑制程度却远低于中膜，这表明内膜SMC不仅具有在受刺激后表达更多iNOS的能力，而且对iNOS的产物―NO的抗增殖作用具有抗性. 这就解释了为什么内膜SMC可以在高浓度NO环境下仍然存活并具有较高的增殖特性. 也就是说，虽然血管损伤后iNOS大量表达可产生高水平NO，但对于“迟钝”的内膜SMC来说依然是不够的. 我们观察到支架置入损伤血管后虽然iNOS高表达，NO水平上升，但内膜增生非常显著，二烯丙基三硫化物涂层支架进一步增加损伤局部iNOS蛋白表达量，提高NO水平后，内膜增生受到抑制也证实了这一发现.
　　

二烯丙基三硫化物具有抗血栓、扩血管以及抑制VSMC增殖等多种生物学作用，而这些生物学效应也被NO所具有的，提示二烯丙基三硫化物可能通过NO途径发挥作用. 为此，研究者分别从体外、体内和临床观察等不同角度研究了二烯丙基三硫化物与NO，iNOS的关系［7-12］，发现二烯丙基三硫化物在体外可通过NO产生舒血管作用、提高血小板内和胎盘绒毛膜组织和绒毛膜癌组织中iNOS和NO水平，进一步体内研究表明二烯丙基三硫化物的舒血管作用与增加NO产量有关，临床试验也发现，二烯丙基三硫化物治疗冠心病心绞痛的作用与升高患者血浆中NO水平有关. 以上资料显示了二烯丙基三硫化物的治疗效应与iNOS和NO密切相关. 我们首次观察了二烯丙基三硫化物在体内抑制血管损伤后内膜增生的作用与iNOS和NO的关系，结果显示二烯丙基三硫化物涂层支架植入血管后iNOS蛋白的表达明显增加，NO水平显著升高，提示这可能是二烯丙基三硫化物涂层支架抑制内膜增生的一个重要机制.
　　支架置入术后血管壁iNOS动态高表达和NO水平的变化，是机体的一种保护性代偿反应；二烯丙基三硫化物涂层支架可显著增加iNOS表达，提升NO产量，这可能是大蒜素涂层支架抑制内膜增生的一个重要途径，表明血管损伤后提高局部NO浓度可减轻再狭窄，这为将来开发新的支架提供了思路.
　　【参考文献】
　　［1］ Yan ZQ, Hansson GK. Overexpression of inducible nitric oxide synthase by neointimal smooth muscle cells ［J］. Circ Res, 1998, 82(12): 21-29.
　　［2］   Fernando GF, Antonio LF, Juan RF, et al. Expression of inducible nitric oxide synthase after endothelial denudation of the rat carotid artery ［J］. Circ Res, 1998,83:1080-1087.
　　［3］   Hansson GK, Geng YJ, Holm J, et al. Arterial smooth muscle cells express nitric oxide synthase in response to endothelial injury ［J］. J Exp Med, 1994,180: 733-738.
　　［4］   Banning AP, Groves PH, Buttery L, et al. Reciprocal changes in endothelial and inducible nitric oxide synthase expression following carotid angioplasty in the pig ［J］. Atherosclerosis, 1999,145:17-32.
　　［5］   Nie XM, Jiang H, Li GS, et a

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